2021年3月10日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所王曉月團(tuán)隊(duì)在Genome Biology發(fā)表了“Identification of pathogenic variants in cancer genes using base editing screens with editing efficiency correction”的論文。研究以單堿基編輯工具為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)出一種可以高效研究核苷酸變異功能的高通量篩選方法。
復(fù)雜疾病相關(guān)變異的功能鑒定一直是遺傳學(xué)研究中的重要問(wèn)題。腫瘤患者中含有大量的核苷酸變異，包括遺傳性變異和體細(xì)胞變異，這些變異的致病性判斷對(duì)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、干預(yù)和治療都具有重要的意義。受到技術(shù)限制，目前仍缺乏能夠高效評(píng)估這些變異功能的高通量篩選平臺(tái)。近年來(lái)，基于CRISPR/Cas9的單堿基編輯器的出現(xiàn)使人們可以在基因組的特定位置上實(shí)現(xiàn)C-T [1]和A-G [2]的單點(diǎn)突變，為高通量鑒定點(diǎn)突變的功能提供了可能。2021年2月兩篇背靠背發(fā)表在Cell雜志上的文章，采用單堿基編輯器CBE (Cytosine Base Editor)，對(duì)BRCA1/2等DNA損傷應(yīng)答基因的部分點(diǎn)突變進(jìn)行了高通量功能篩選[3, 4]。因?yàn)檫@些基因的有害突變對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有負(fù)面影響，通過(guò)堿基編輯后不同sgRNA的豐度變化，可以評(píng)估其對(duì)應(yīng)的變異對(duì)基因功能的影響。然而由于單堿基編輯器工具在基因組不同位點(diǎn)上的編輯效率存在顯著差異，并且同一個(gè)向?qū)?span style="font-size:18px;font-family:'times new roman'">RNA(sgRNA)可能會(huì)在基因組上產(chǎn)生不止一種突變，篩選得到的sgRNA對(duì)應(yīng)的基因變異效應(yīng)可能并不符合預(yù)期。
針對(duì)這一問(wèn)題，王曉月團(tuán)隊(duì)提出了結(jié)合效率校正的單堿基編輯高通量篩選方法。這一方法通過(guò)對(duì)sgRNA編輯結(jié)果的高通量測(cè)定，將sgRNA和所產(chǎn)生的變異精確對(duì)應(yīng)，再使用一個(gè)效率校正模型去將sgRNA對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)轉(zhuǎn)化為變異的致病性得分，從而提升變異功能評(píng)估的準(zhǔn)確性(如圖1所示)。作者發(fā)現(xiàn)，使用效率校正可將已知致病性突變的檢出率提高50%以上。
圖1結(jié)合單堿基編輯效率校正的鑒定有害突變的高通量篩選方法
運(yùn)用這種方法，王曉月團(tuán)隊(duì)使用單堿基編輯工具CBE和ABE(Cytosine Base Editor)對(duì)兩個(gè)腫瘤抑制基因BRCA1和BRCA2的 9000多種變異進(jìn)行了高通量功能分析，共鑒定出了910種可能影響BRCA1/2功能的變異。這是目前針對(duì)BRCA1/2基因全長(zhǎng)范圍的最大規(guī)模的突變功能篩選，篩選得到的有害變異廣泛分布于兩個(gè)基因編碼蛋白的不同結(jié)構(gòu)域，為BRCA1/2蛋白的功能解析提供了新的線索。值得注意的是，鑒定出的變異中包括一些在腫瘤家系中存在、而在臨床上被判定為意義不明的遺傳性變異，說(shuō)明這些位點(diǎn)的致病性可能需要重新判別。這種基于單堿基編輯的高通量篩選方法可以廣泛應(yīng)用于基因組不同位置的變異功能解析，將為腫瘤等疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和精確診療提供重要信息。
本研究工作得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程(2017-I2M-4-003，2019-I2M-1-004)等項(xiàng)目的資助。基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所王曉月教授和梁俊波博士為論文共同通訊作者，黃昌財(cái)博士和李光宇碩士為論文的共同第一作者。
論文鏈接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02305-2
基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
2021年3月16日
